西暦2205年。
歴史の改変を目論む「歴史修正主義者(れきししゅうせいしゅぎしゃ)」によって過去への攻撃が始まった。
時の政府は「審神者(さにわ)」なるものたちに歴史の守護を命じる。
その審神者の物の心を励起(れいき)する力によって生み出された「刀剣男士(とうけんだんし)」たちは、さだめられた歴史を守る戦いへと身を投じるのだった。

本丸に、なにものかによりもたらされた入電。
その入電に込められた和歌の意図を汲み取った歌仙兼定は、山姥切長義、篭手切江、にっかり青江、獅子王、亀甲貞宗と共に、慶長元年の熊本へと出陣する。熊本城下町へと到着した刀剣男士はすぐさま異変に気付く。そこは、弾圧を逃れた全国のキリシタンたちが集う地となっていたからだ。異変の原因を調査するため、刀剣男士たちは三方に分かれて行動することとなる。

山姥切長義と亀甲貞宗は、調査の途中でキリシタン大名である大村純忠と有馬晴信に遭遇。篭手切江と獅子王は、同じくキリシタン大名である高山右近と小西行長に遭遇する。

熊本城を眺める場所を訪れた歌仙兼定とにっかり青江は、そこで入電を送った張本人である古今伝授の太刀と出会う。古今伝授の太刀から、この歴史改変の中心にいる人物が、細川ガラシャであることを聞かされる歌仙兼定。そのガラシャは、古今伝授の太刀と共にこの時代の先行調査に訪れていた地蔵行平が、熊本城から連れ出して行方知れずとなっていた。

キリシタン大名たちの総大将である大友宗麟と、軍師・黒田孝高は、ガラシャの行方を追うために宗麟の従者である伊東マンショ、千々石ミゲル、中浦ジュリアン、原マルティノら、天正遣欧少年使節にガラシャの奪還と刀剣男士たちの排除を命じる。

ガラシャを中心にそれぞれの陣営が動き出す。やがて、歴史改変の渦巻く放棄された世界「慶長熊本」にて、歌仙兼定は元主である細川忠興と邂逅する。

一方、情報を得るために敵地での会談に挑む山姥切長義と亀甲貞宗。山姥切長義は、会談に同席した黒田孝高に言い知れぬ不気味さを感じるのだった。